特殊な授業を受け、能力を得たお馴染みのメンバーたちと平和で平凡で、ちょっぴり変わった学園都市的日常生活を送っていた美琴に、突然、学園都市の「闇」が迫る――。
東京都西部に広がる「学園都市」では超能力の開発が行われていた。その学園都市で最強と謳われる7人の中の1人・御坂美琴。「超電磁砲(レールガン)」の異名を持つ彼女と、その仲間たちのもとにある日突然、学園都市に隠された闇が迫る。
180万人を超える学生が集い超能力開発が行われている「学園都市」。教師によるボランティア組織「警備員」や学生による「風紀委員」が都市を守る一方で、路地裏にはいたいけな少女に絡む不良学生たちがいた。
24分「広域社会見学」を前に買い物に出掛ける美琴たち。ショッピングモールへの近道を選ぶと、狭い裏路地に多くの学生たちがいた。不思議に思う美琴たちは、その原因となっている「マネーカード」の入った封筒を拾う。
24分いるはずのないところで目撃され、超能力者・レベル5のクローン製造計画と軍事利用、そしてそれが自分のDNAをもとにされているとの噂が広がる。美琴は不思議な少女・布束によってそんな記憶が呼び起こされる。
24分忍び込んだ研究所で美琴は「クローン製造計画の中止」を知った。自分のDNAマップが悪用されなかったことを確認し、晴れやかな気持ちになった美琴は、初春や佐天たちと一緒にショッピングに出掛ける。
24分自分と同じ能力に干渉されたような気味の悪い感覚に導かれ、美琴がたどり着いた先には常盤台中学の制服を着た少女がいた。それは自分とそっくりの少女だ。沈黙が支配するなか、少女が奇妙なひと言を発した。
24分中止されたはずの計画が続行されていた。「妹達」を運用した絶対能力者・レベル6への進化法だ。予想以上の実験内容に大きなショックを受けながらも、突き止めた実験場に着いた美琴を、無残な光景が待ち受けていた。
24分「実験」の名のもとに次々と命を落としていく「妹達」。殺される運命を受け入れた彼女たちの姿と、何よりも過去の自分の行動によって「実験」が成立している事実に対し、美琴は深い罪の意識を抱いた。
24分「妹達」とそれに関わる「実験」を中止に追い込む決意をした美琴により、次々と稼働不能にされた研究施設も残すところあと2カ所。だが、「実験」を行う者たちも、ただ手をこまねいていたわけではなかった。
24分施設防衛の依頼を受けた暗部組織「アイテム」の1人、フレンダによって張り巡らされたわなを突破し彼女を追い詰めた美琴。そんな時、「アイテム」のリーダーで第4位の超能力者・レベル5の麦野沈利が現れた。
24分「原子崩し」と「能力追跡・AIMストーカー」。これら「アイテム」の強力な連携で美琴は追い詰められる。追う側である麦野は、現在戦っている相手を学園都市第3位の「超電磁砲」と認め、一騎討ちを挑む。
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