圧倒的クオリティで描く本格剣戟アクションが見どころ。これまでのufotable作品を支えたベテランアニメーター3名が、"剣戟専任"アニメーターとして、作品制作を支える。
倒幕派と佐幕派が世を二分し、刀の時代が終わりを告げた時代。歴史を変えようと目論み未来から送り込まれる『時間遡行軍』を打倒し、“正しい歴史”を守るべく、刀剣男士達は、動乱の時代の中で時間遡行軍との戦いに身を投じていた…。
付喪神「刀剣男子」である和泉守兼定は、歴史を改変すべく現れる時間遡行軍からとある積み荷を奪取するため、初陣の堀川国広と共に幕末の世に出陣する。辛くも任務を遂行した二振りに新たな指令が下されるが…。
24分新たに陸奥守吉行、薬研藤四郎、蜻蛉切を加え、時間遡行軍を追って城を目指す審神者と和泉守たち。しかし、城内に先行した陸奥守は、時間遡行軍の手に掛かって命を落とした城侍の姿を目の当たりにする。
24分停泊していた蒸気船が爆発し騒然とする港。船内から生存者を助けた陸奥守だが、救えなかった人々への悔しさを部隊長である和泉守にぶつける。急造の編成で、第二部隊の刀剣男士たちは孤立してしまい…。
24分慶応四年三月。和泉守ら第二部隊は、勝海舟と西郷隆盛の会談を歴史通りに終わらせるべく江戸を訪れる。そして会談最終日、時間遡行軍が行動を起こす。周囲を警戒する第二部隊の前に現れたのは大太刀だった。
24分時空の歪みから現れたのは第二部隊最後の刀剣男士・鶴丸国永だった。窮地に陥った薬研を救った鶴丸は、和泉守、陸奥守と共に軍艦を取り戻す。一方、屋敷周辺に残った蜻蛉切と堀川は強敵・大太刀に圧倒されていた。
24分本丸へ帰還した第二部隊。会談を守ることには成功したものの、和泉守と蜻蛉切は時間遡行軍との戦いで深手を負っていた。和泉守は仲間やその時代の人々や町に大きな被害が出てしまったことに苦悶する。
24分第二部隊が本丸へと帰還する一方、永禄八年の京都へと出陣した第一部隊。山姥切国広を隊長とする第一部隊は、時間遡行軍の狙いを探るために京の都へ向かうが、そこで鬼の面をつけた辻斬りのうわさを耳にする。
24分正体不明の辻斬りを討伐した第一部隊は、戦いに巻き込まれた人々のためにできることをしようと京に残る。その頃、歴史を守ることの意味を考え続けていた和泉守は、自ら第二部隊の刀剣男子たちに声を掛けて回り…。
24分心新たに第二部隊が出陣したのは慶應二年の京都・伏見。薩長同盟を成し遂げた坂本龍馬が襲撃を受ける「寺田屋事件」への介入が時間遡行軍の狙いだと考えた第二部隊は、陸奥守を中心に奔走するが…。
24分歴史通りに『寺田屋事件』を死守した第二部隊。一行は伏見に留まるようにとの審神者の指令のもと、引き続き坂本龍馬を護衛することに。それはこの地に時間遡行軍が潜伏している可能性があると観測されたためだった。
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