「必殺仕事人」「新・必殺仕事人」から続く第3弾。藤田まこと演しる中村主水らおなじみの仕事人たちに加え、当時ジャニーズアイドルのひかる一平が新メンバーとして登場。
再びチームを組む主水、秀、勇次、加代、おりくだったが、殺しの現場をある若者に目撃されてしまう。その若者は、西洋医学を志し、医学所に入るべく受験勉強中の順之助。主水たちは掟にのっとって順之助を始末しようとするのだが…。
暗夜に紛れ、悪人たちを仕留める主水たち。しかし、その現場を通り掛かった少年・西順之助に目撃されてしまう。主水たちは順之助を捕らえたが、若者を殺すのは寝覚めが悪い。主水は、順之助を解放することにした。
46分両替商・分銅屋の奥女中お袖は、相場師の与吉に騙され、500両を貢いでお縄に。与吉は死罪、お袖は処払いの裁きを受けたが、彼女は湯女風呂勤めで大評判に。与吉の女房お力は、お袖へ怒りを募らせる。
46分少年変死事件が相次ぐ中、主水宅に「秘密をばらされたくなければ百両用意せよ」という脅迫状が届く。主水は調査を始め、美少年を使った強請り一味の存在を知る。その頃、順之助の同級生・周平に魔の手が…。
46分加代は、幼馴染みのおかよと偶然再会する。彼女は旗本の次男坊・新二郎と恋仲で、所帯を持つ予定だ。しかし、その直後おかよは火事で焼死してしまう。これに疑念を抱いた加代は、新二郎の縁談話を聞きつける。
46分御公儀御鏡師・矢野道斎の妻・お銀は、夫の弟子・道有と不義密通の間柄だ。一方、作事方の役人・木田と河野は、賄賂の増額を道斎に要求して、断られていた。道斎が邪魔なこの4者は結託して殺そうとする。
46分捕縛術指南の実験台として奉行所へ連れて来られた女囚・お咲が、主水によって女牢まで護送される。道中、お咲は具合を悪くし、妊娠していることが判明。お咲は、5年前から男子禁制の女牢にいたのだが…。
46分ある晩勇次は、店先で捨て子を見つける。その子の懐には勇次宛の手紙があり、赤ん坊の名前は「勇太」と書かれていた。この子は、かつての勇次の弟子・お小夜の子であった。彼女には、深い事情があり…。
46分撃ち殺された人夫の死体が大川に上がった。鉄砲密売組織の仕業と見た奉行所は、探索を開始。そんな中、主水の同僚の老同心・島田忠信の息子・信一郎が、岡っ引の平助を撃ち殺したとして無実を訴えながら処刑される。
46分入札によって決定する江戸城の畳替えは、安価でも丁寧な仕事が評価された畳問屋・泉屋がここ数年は一手に引き受けていた。しかし、この仕事を奪おうと考えた能登屋は、佐竹藩の江戸詰家老補佐と同心を抱き込み…。
46分釣り糸の先に一分銀を付け、拾おうとした大人をからかう悪戯が子供たちの間で流行り、主水も引っ掛かった。そんな中、浪人・真辺紳之進がこの悪戯に遭い、怒って呉服商・伊勢屋の跡取り息子を叩き斬ってしまう。
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